液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)原理

1）離子阱的構(gòu)成和操作

離子阱為一個(gè)離子存儲(chǔ)裝置，主要由一個(gè)環(huán)形電極和置于電極上下兩端的兩個(gè)端蓋電極構(gòu)成。三個(gè)電極的內(nèi)表面呈近似雙曲線型。處在端蓋電極中心的小孔允許離子進(jìn)出該阱。一定固有頻率的射頻電壓施加于環(huán)（電極）上，電壓(0～12 000V）回路接地點(diǎn)為端蓋電極(0～20V)，這樣就在環(huán)電極和端蓋電極之間建立了一個(gè)高頻（電）勢(shì)差，形成了一個(gè)四級(jí)場(chǎng)。依靠這個(gè)具有不同射頻電壓（VRf）值的四級(jí)場(chǎng)，離子阱可以在一個(gè)特定的質(zhì)量范圍內(nèi)俘獲并穩(wěn)定一定數(shù)量的離子。四級(jí)場(chǎng)可以看作一個(gè)三維的“槽”或是一個(gè)偽勢(shì)阱（離子阱由此而得名）。這個(gè)勢(shì)阱的“深度”與粒子質(zhì)量、射頻電壓有關(guān)，在儀器實(shí)際設(shè)計(jì)中，勢(shì)場(chǎng)要能在足夠?qū)挼馁|(zhì)量范圍內(nèi)對(duì)離子產(chǎn)生作用力，這樣儀器才可以進(jìn)行質(zhì)譜的全掃描并同時(shí)兼顧足夠的靈敏度。

另一路射頻輔助電壓被施加在離子阱的出口端蓋電極上，這個(gè)附加電壓在掃描的不同階段，即前體離子的分離、碎片化和質(zhì)量分析階段，可用于不同的目的。

由于LC-離子阱質(zhì)譜的離子不是產(chǎn)生于阱內(nèi)而是來自于阱外，這樣就需要一個(gè)機(jī)制來解釋為什么它們可以被離子阱產(chǎn)生的偽勢(shì)阱所俘獲。實(shí)際上離子阱的設(shè)計(jì)無需其他手段，被聚焦的外部離子可以容易地通過第一個(gè)端蓋“滾入”另一個(gè)阱內(nèi)四級(jí)場(chǎng)產(chǎn)生的偽勢(shì)阱中，并且由于能量守恒規(guī)定它們要持續(xù)“上下滾動(dòng)”或由另一個(gè)端蓋逸出離子阱。由于這個(gè)原因和其他原因，阱內(nèi)設(shè)計(jì)了碰撞氣體(He)，碰撞氣體（也稱為阻尼氣體）分子的存在是非常有必要的，因?yàn)樗梢晕针x子束的能量，并導(dǎo)致一定份額進(jìn)入阱內(nèi)的離子駐留。其他影響阱俘獲效率的參數(shù)有進(jìn)入阱內(nèi)的離子束的能量、離子的質(zhì)量及其m／z、勢(shì)阱的深度以及Rf在離子注入點(diǎn)上的實(shí)際位相。各種離子的俘獲率可以不相同，對(duì)于m/z 500(單電荷）的離子，當(dāng)阱內(nèi)的操作壓力為0.1Pa(10-6 bar）時(shí)，其俘獲率應(yīng)為5％左右。

由于離子阱是一個(gè)（離子）存儲(chǔ)裝置，因此它可以在一個(gè)希望的時(shí)間范圍內(nèi)積累信號(hào)。如果進(jìn)入阱內(nèi)的離子信號(hào)較強(qiáng)，累積時(shí)間可以短到lms，但在痕量物質(zhì)的注入實(shí)驗(yàn)中，它可以增加到1s。質(zhì)譜和質(zhì)譜一質(zhì)譜測(cè)定中，典型的累積時(shí)間設(shè)置為0.01～200ms。通過變化累積時(shí)間，離子阱分析器的動(dòng)態(tài)質(zhì)量范圍可以獲得很大的發(fā)展。

2）離子阱質(zhì)譜的產(chǎn)生

1～4個(gè)分立事件被連接成為一個(gè)連續(xù)事件時(shí)就構(gòu)成了一個(gè)掃描連續(xù)過程。這個(gè)連續(xù)過程的示意圖總結(jié)了主射頻（Rf)電壓（primary Rf電壓，施加在環(huán)電極和兩個(gè)端蓋電極之間）和輔助Rf電壓施加的時(shí)間協(xié)同（圖中采樣錐孔含有開啟和關(guān)閉兩個(gè)動(dòng)作），表明了振動(dòng)和清除)以及質(zhì)譜的最終產(chǎn)生。

離子阱的質(zhì)譜過程發(fā)生時(shí)，首先是離子被充入離子阱，這是通過降低施加在采樣錐孔上的排斥電壓，讓離子束通過來實(shí)現(xiàn)；進(jìn)入阱內(nèi)的離子被施加了低于四級(jí)振幅的射頻場(chǎng)俘獲。經(jīng)一定設(shè)置時(shí)間的累積后，采樣錐孔的排斥電壓升高，以阻止后續(xù)離子進(jìn)入阱內(nèi)。累積的離子被阱內(nèi)浴氣（He)通過碰撞而“冷卻”，以確保離子“云”定位（駐留）于阱中心一定的空間范圍內(nèi)。掃描開始后，四級(jí)和二級(jí)的勢(shì)場(chǎng)增加，離子按質(zhì)量增加的順序通過出口端蓋被“逐出”離子阱。掃描結(jié)束，四級(jí)場(chǎng)將低到零以清除殘留在阱內(nèi)的離子。然后，阱回到初始狀態(tài)，采樣錐孔設(shè)置為允許離子進(jìn)入并累積的開啟狀態(tài)，新的循環(huán)（cycle）開始。

3）Mathieu穩(wěn)定圖

描述的離子穩(wěn)定區(qū)域可以用一個(gè)簡(jiǎn)單的方程來表達(dá)，方程式中，q的穩(wěn)定性與射頻頻率（W）、射頻電壓（VRf)、離子質(zhì)量（m)、離子電荷（z)及離子阱的曲率半徑（ro）有關(guān)。通常儀器操作中ro為常數(shù)，因此由此方程可以看出，穩(wěn)定性因離子的質(zhì)量、電荷及所施加的射頻頻率和電壓而變化。

因此有四種途徑擴(kuò)展阱的質(zhì)量范圍，如升高環(huán)電極上的Rf電壓，降低射頻頻率W，減小阱的尺寸ro。

被俘獲于阱內(nèi)的離子會(huì)在徑向（radial)和軸向（axial）上經(jīng)歷周期性的運(yùn)動(dòng)。沿端蓋方向的運(yùn)動(dòng)是第一位重要的，因?yàn)樗请x子進(jìn)入阱內(nèi)和逸出阱外的方向。產(chǎn)生勢(shì)阱的四級(jí)場(chǎng)會(huì)使離子產(chǎn)生諧振，這一主要的勢(shì)場(chǎng)分量可以被認(rèn)為是離子的“長(zhǎng)期頻率”（也可以認(rèn)為是在特定條件下特定離子的固有頻率）。離子諧振的實(shí)際頻率將主要由離子的m/z和Rf的驅(qū)動(dòng)水平?jīng)Q定。

較低的M／二值產(chǎn)生較高的長(zhǎng)期頻率；可以同時(shí)被勢(shì)阱俘獲的離子質(zhì)量范圍可由一個(gè)穩(wěn)定圖來說明。穩(wěn)定圖是一個(gè)二維圖，它表明了在什么樣的特定勢(shì)場(chǎng)內(nèi)（包括Rf分量和施加在環(huán)電極和端蓋之間的直流分量），一個(gè)特定m／z的離子的穩(wěn)定與否。如圖中的直線所標(biāo)明的，如果以單一Rf模式工作，隨著Rf驅(qū)動(dòng)水平的增加，給定質(zhì)量的離子在圖上的相應(yīng)穩(wěn)定點(diǎn)將向右移動(dòng)。較大質(zhì)荷比（m/z)的離子位于較小質(zhì)量離子的左邊，即M2>M1。對(duì)于穩(wěn)定區(qū)域內(nèi)的任何一個(gè)給定點(diǎn)，某一離子會(huì)處在一個(gè)不同深度的勢(shì)阱中，因而有一個(gè)特定的長(zhǎng)期頻率（動(dòng)態(tài)固有頻率）。

從穩(wěn)定圖可以得出一個(gè)重要的推論，即截止質(zhì)量的存在。圖示表明沿著曲線q=1為一個(gè)離子能量穩(wěn)定區(qū)域邊界。如果一個(gè)離子接近了穩(wěn)定區(qū)域的邊界（q=0或q=1)，離子的運(yùn)動(dòng)軌跡將變得不穩(wěn)定，因而會(huì)沿軸向離開離子阱。這意味著有一個(gè)最低的穩(wěn)定質(zhì)量和所有較低的不穩(wěn)定質(zhì)量共存于場(chǎng)內(nèi)，于是同時(shí)存儲(chǔ)于阱內(nèi)離子的質(zhì)量范圍就有一個(gè)下限，即截止（cut-off)質(zhì)量。截止質(zhì)量取決于環(huán)電極上的Rf電壓水平，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)截止質(zhì)量就是長(zhǎng)期頻率接近Rf驅(qū)動(dòng)頻率的一半時(shí)該離子的質(zhì)量。

理論上，可被存儲(chǔ)的離子質(zhì)量范圍沒有上限，但由于熱力學(xué)的原因，對(duì)于實(shí)際使用是存在一個(gè)上限，這個(gè)上限是截止質(zhì)量的20～30倍；超過此上限的離子不能被Rf場(chǎng)俘獲。

4）離子阱中分辨率、質(zhì)量范圍和掃描速度的關(guān)系

離子阱的分辨率取決于掃描范圍和掃描速度，當(dāng)掃描速度為每秒幾百個(gè)質(zhì)量單位時(shí)，分辨率將小于四極桿質(zhì)譜。但是如果以低掃描速度對(duì)很小的質(zhì)量范圍進(jìn)行掃描時(shí)，分辨率可以增加。比如掃描范圍為10Da時(shí)，分辨率可以達(dá)到5000，這個(gè)分辨率足以測(cè)定一個(gè)小分子肽的多電荷峰。與四極桿質(zhì)譜相比，由于在一定的分辨率要求下其掃描速度較慢，離子阱在相同時(shí)間下、相同的掃描質(zhì)量范圍內(nèi)可采集到的數(shù)據(jù)點(diǎn)較少，因此它的定量精度比串級(jí)四極桿要差。這就是在定量測(cè)定為主的工作中優(yōu)先考慮采用串級(jí)四極桿質(zhì)譜的原因。

5）用離子阱完成質(zhì)譜／質(zhì)譜測(cè)定

用離子阱隔離一個(gè)感興趣的特定離子的方法是，增加Rf電壓以消除較低的質(zhì)量數(shù)，調(diào)整端蓋電極的電壓以消除較高的質(zhì)量數(shù)，這樣就在一定質(zhì)量范圍內(nèi)把特定一個(gè)或一些質(zhì)量的離子駐留在阱中。

駐留于阱中的離子在增加Rf電壓的作用下，以一種搖動(dòng)的方式分裂，然后被掃描得到它的二級(jí)質(zhì)譜。由于每一個(gè)離子都有其自身的共振頻率，所以產(chǎn)物離子不會(huì)被進(jìn)一步分裂，導(dǎo)致有限但簡(jiǎn)明的質(zhì)譜信息。為了得到更為豐富的質(zhì)譜信息，發(fā)展了寬帶活化技術(shù)，此技術(shù)可用于離子阱質(zhì)譜庫(kù)的建立，但應(yīng)用此技術(shù)得到的質(zhì)譜與四極桿和三級(jí)四極桿所得到的質(zhì)譜有所不同。

6）阱中電荷密度

離子阱的分辨率和狀態(tài)取決于阱內(nèi)離子的電荷密度，如果同一時(shí)間內(nèi)阱內(nèi)的離子過多，阱內(nèi)的電場(chǎng)會(huì)扭曲，同時(shí)離子之間的碰撞會(huì)發(fā)生，導(dǎo)致不希望有的離子分裂或發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。在這種情況下會(huì)出現(xiàn)分辨率下降、質(zhì)量精度下降和動(dòng)態(tài)范圍的下降，此時(shí)意味著阱內(nèi)已經(jīng)接近或達(dá)到了空間電荷極限。因此在實(shí)際儀器設(shè)計(jì)中，一般都有累積時(shí)間和阱內(nèi)清除的編程功能。